Un thermocycleur est un équipement de laboratoire qui permet d’effectuer la réaction en chaîne de la polymérase (PCR) de manière efficace et rapide, par la réalisation automatique et cyclique des changements de température requis pour l’amplification d’une chaîne d’acide désoxyribonucléique (ADN), à partir d’une enzyme thermostable. La PCR permet à une petite quantité de molécules d’ADN d’être amplifiée de nombreuses fois, de manière exponentielle.

Le protocole de cette technique consiste à synthétiser plusieurs fois un fragment d’ADN en utilisant une enzyme polymérase qui peut travailler à des températures très élevées, car elle provient de la bactérie Thermus aquaticus qui vit à des températures élevées (79°C à 85°C), connue sous le nom de taq polymérase.

Lorsque nous effectuons une réaction PCR, nous simulons ce qui se passe à l’intérieur des cellules lorsque l’ADN est synthétisé et tous les ingrédients nécessaires pour le faire sont mélangés dans le tube : la polymérase, l’ADN de l’organisme que nous voulons étudier, les oligonucléotides (premiers, initiateurs, amorceurs) nécessaires pour que la transcription commence, les dinucléotides (dNTPs), et les conditions pour que l’enzyme fonctionne correctement (certain pH, certaines quantités de magnésium sous forme de MgCl2, KCl, et d’autres sels ou réactifs peuvent être nécessaires, selon chaque polymérase ). Cette technique a de nombreuses applications différentes et est devenue un outil très important en biologie moléculaire ; ses applications vont de la génétique des populations, l’évolution moléculaire et génomique à la médecine légale.

Comment fonctionne la technique PCR ?

Si nous avons déjà les tubes avec tout ce qu’il faut pour que la synthèse du fragment que nous souhaitons réaliser (taq polymérase, dinucléotides, ADN, eau, tampon avec du magnésium et d’autres sels, et oligonucléotides). L’étape suivante consiste à placer les tubes dans le thermocycleur, qui sert essentiellement à les chauffer ou à les refroidir à des températures très précises.

Comment le fragment d’ADN que nous voulons est-il amplifié ?

Le thermocycleur chauffe ou refroidit les tubes à trois températures différentes, qui se répètent encore et encore (connues sous le nom de cycles de réaction), la première est à 95 °C (dénaturation) pendant laquelle les doubles chaînes d’ADN s’ouvrent ou se dénaturent, en restant sous la forme de chaînes simples ; puis le thermocycleur ajuste la température dans un intervalle entre 40 °C et 60 °C (alignement), à cette température se forment et se rompent constamment les ponts d’hydrogène entre les oligonucléotides et l’ADN, et les liaisons plus stables (qui sont complémentaires) dureront plus longtemps, des oligonucléotides « alignés » formant une petite région à double chaîne. La polymérase se fixe sur ce petit morceau d’ADN à double brin).

La polymérase se lie à ce petit morceau d’ADN à double chaîne et commence à copier dans le sens 5’ à 3’; en ajoutant quelques bases supplémentaires, les ponts d’hydrogène qui se forment entre les bases stabilisent davantage la liaison et l’oligonucléotide reste à cet endroit pour l’étape suivante. Ensuite, la température monte à 72 °C (étape connue sous le nom d’extension), puisque 72 °C est la température à laquelle la polymérase atteint son maximum d’activité, et continue la synthèse des fragments d’ADN à partir des oligonucléotides qui s’étaient déjà alignés.

Dans le premier cycle, avec ces trois températures, les premiers fragments d’ADN génomique se formeront. Ensuite, les trois températures se répètent une fois de plus, mais dans ce deuxième cycle, les oligonucléotides, en plus de se lier à l’ADN que nous avons mis au début, se lieront aussi aux fragments nouvellement synthétisés du premier cycle, donc, dans cette deuxième étape, la polymérase synthétisera deux longs fragments directement copiés à partir de l’ADN et deux fragments de la taille attendue, qui est la taille entre les deux oligonucléotides que nous avons utilisés. De cette façon, avec chaque cycle, vous augmenterez le nombre de fragments de la taille que vous voulez.

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