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Qu’est-ce que l’électrophorèse bidimensionnelle ?

L’électrophorèse bidimensionnelle est un type spécial d’électrophorèse, considérée comme une technique à haute résolution qui permet la séparation de mélanges de protéines complexes, grâce à sa bidimensionnalité, une caractéristique distinctive qui offre son pouvoir de résolution.

Dans cette technique, les protéines sont séparées séquentiellement par deux critères physiques. Dans un premier temps, les protéines sont séparées sur un gel à gradient de pH dans un environnement dénaturant en fonction de leur point isoélectrique (focalisation isoélectrique). Après cette séparation de charges, les protéines sont séparées selon leur masse moléculaire ou leur taille par électrophorèse discontinue sur gel de polyacrylamide en présence de SDS (SDS-PAGE).

L’électrophorèse bidimensionnelle (IEF + SDS-PAGE) est la technique la plus utilisée pour l’analyse globale et la séparation des composants du protéome (ensemble de protéines exprimées à partir d’un génome à un instant donné).

Focalisation isoélectrique (IEF)

La focalisation isoélectrique est un type d’électrophorèse utilisé pour séparer les molécules chargées. Il est basé sur le fait qu’une protéine a des groupes chargés des deux polarités, elle a donc un point isoélectrique (pI) qui correspond à la valeur du pH auquel la molécule a une charge nette (z) égale à zéro (zwitterion), et il est donc immobile dans un champ électrique. En appliquant la différence de potentiel, les protéines trouvées dans les régions de pH inférieur à leur point isoélectrique seront chargées positivement, et migreront vers la cathode ; tandis que ceux qui se trouvent dans des régions de pH supérieur à leur point isoélectrique auront une charge négative et migreront vers l’anode.

Électrophorèse SDS-PAGE

Dans ce type d’électrophorèse, on utilise du dodécyl sulfate de sodium (SDS), qui est un détergent largement utilisé dans les préparations biochimiques car il se lie fermement aux protéines et leur fait adopter une structure désordonnée afin d’obtenir une dénaturation efficace. Cette technique permet la séparation des protéines dans l’ordre de leurs masses moléculaires par des effets de filtration sur gels.

Étapes de l’électrophorèse bidimensionnelle

  • Préparation des échantillons : Des agents chaotropes, des tensioactifs et des agents réducteurs sont utilisés ici. Les agents chaotropes, tels que l’urée, provoquent la dénaturation des protéines en rompant les liaisons hydrogène, exposant les résidus hydrophobes qui sont solubilisés par les agents tensioactifs. Les agents réducteurs, tels que le DTT (dithiothréitol, bien que d’autres réducteurs non chargés alternatifs soient également utilisés), complètent la dénaturation des protéines en brisant les ponts disulfures.
  • Séparation dans la 1ère dimension (focalisation isoélectrique) : Le mélange de protéines est séparé selon ses points isoélectriques.
  • Séparation dans la 2e dimension (SDS-PAGE) ; Les protéines sont séparées en fonction de leur poids moléculaire.
  • Révélé; Les méthodes les plus couramment utilisées sont la coloration au bleu de Coomassie qui se lie aux protéines mais pas au gel, la coloration fluorescente Sypro Ruby et la coloration à l’argent. La coloration au bleu de Coomassie classique peut généralement détecter des bandes de protéines de 50 ng, tandis que la coloration à l’argent augmente cette limite de sensibilité d’environ 50 fois.

Applications de l’électrophorèse bidimensionnelle

La principale application de l’électrophorèse bidimensionnelle est la protéomique d’expression ; Avec cette technique, l’expression protéique de deux échantillons peut être comparée qualitativement et quantitativement. Il a été largement utilisé dans la préparation de cartes de référence, c’est-à-dire dans la dissection de la composition protéique d’un certain organite cellulaire. Ces cartes sont utilisées pour comparer diverses expériences, telles que des traitements avec des médicaments ou des composés toxiques, des tissus sains ou malades, des conditions de culture, des lignées cellulaires normales et tumorales, c’est là que l’électrophorèse bidimensionnelle acquiert sa fonctionnalité maximale.

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