Introduction
Les épidémies de diarrhée chez les porcs surviennent le plus souvent en hiver, et le rotavirus porcin (PoRV) est l’une des maladies diarrhéiques importantes. La réaction en chaîne par polymérase numérique en gouttelettes (DDPCR) est une méthode de détection qui permet de quantifier de manière absolue les gènes. Cette étude visait à diagnostiquer l’infection par le PoRV en utilisant une DDPCR basée sur une sonde. Dix porcelets âgés de deux jours présentant une diarrhée légère ont été obtenus dans une ferme porcine commerciale. Aucun PoRV n’a été détecté dans le prélèvement anal à l’aide de bandelettes de test à l’or colloïdal. Pour vérifier les résultats des bandelettes de test à l’or colloïdal, une RT-qPCR a été réalisée, identifiant le PoRV chez six porcelets. Compte tenu de la sensibilité limitée des bandelettes de test à l’or colloïdal et de la RT-qPCR, nous avons développé un test DDPCR ciblant le gène Vp4 du PoRV pour une détection améliorée. Le test DDPCR a démontré des performances optimales à une concentration d’amorce:sonde de 400:400 nM et une température d’hybridation de 57 °C. Il a atteint une limite de détection minimale de 0,21 copies/μL, la sensibilité de détection ayant été améliorée de 100 fois par rapport à la RT-qPCR. En utilisant la méthode de détection DDPCR établie, les quatre échantillons qui ont été testés négatifs par RT-qPCR ont été retestés, et tous se sont révélés positifs au PoRV, indiquant que la sensibilité de la DDPCR était supérieure à celle de la RT-qPCR. Cette étude souligne son potentiel en tant qu’outil précieux pour le diagnostic clinique précoce et le contrôle des maladies chez les porcelets.
Contexte et Importance du PoRV
La diarrhée virale porcine est la principale cause de mortalité élevée chez les porcelets et constitue une menace sérieuse pour l’industrie porcine mondiale. Le rotavirus porcin (PoRV) a été isolé pour la première fois chez les porcs au Royaume-Uni en 1974. Ses symptômes cliniques incluent une diarrhée aqueuse, des vomissements et une anorexie. Le PoRV est un pathogène intestinal qui provoque la diarrhée chez les porcelets nouveau-nés, avec un taux de mortalité pouvant atteindre 95 %. À mesure que les porcs vieillissent, leur résistance augmente progressivement, et les porcs adultes présentent généralement des infections asymptomatiques. Les truies gestantes transmettent le virus aux porcelets par le placenta. De manière préoccupante, le PoRV peut se propager entre les porcs et les humains, posant une menace significative pour la santé publique. La recherche a montré que le PoRV est classé comme la deuxième cause virale la plus courante de diarrhée porcine, avec un taux de prévalence de 25,81 à 50,81 % dans les échantillons et un taux de prévalence dans les fermes de 72,77 %.
Caractéristiques du PoRV
Le PoRV est un virus à ARN double brin non enveloppé et un membre du genre Rotavirus de la famille des Reoviridae. Son génome mesure environ 18 500 pb de longueur et se compose de 11 segments d’ARN double brin codant pour 6 protéines structurales (Vp1–Vp4, Vp6 et Vp7) et 6 protéines non structurales (NSP1–NSP6). Le PoRV est classé en sept sérotypes (A–J) basés sur Vp6. Les protéines structurales Vp7 et Vp4 qui déterminent le génotype forment conjointement la coque externe du RV et sont des antigènes importants pour la neutralisation et l’induction d’anticorps neutralisants. Vp4 est la protéine de la coque externe du PoRV et est responsable de la partie de l’attachement du récepteur lors de l’infection. La protéine Vp4 est également un immunogène vaccinal potentiel contre l’infection par le PoRV, car elle peut induire l’organisme animal à produire des anticorps neutralisants spécifiques et générer une immunité systémique chez les porcelets. En raison de la situation complexe d’infection mixte, de la grande variabilité et de la prévalence mondiale du PoRV, il est progressivement devenu un pathogène important qui provoque la diarrhée chez les porcs. Par conséquent, il est urgent de disposer de techniques de diagnostic rapides et précises pour le PoRV afin de permettre la mise en œuvre immédiate de mesures efficaces de prévention et de contrôle après le diagnostic, réduisant ainsi les pertes économiques dans l’industrie porcine.
Méthodes de Détection du PoRV
Diverses méthodes sont disponibles pour la détection du PoRV, y compris l’isolement viral, l’immunofluorescence indirecte, la RT-qPCR en temps réel et le dosage immuno-enzymatique. La RT-qPCR a été largement utilisée pour l’identification et le typage des PoRV en raison de sa sensibilité et de sa spécificité relativement élevées pour les gènes cibles. Il a été rapporté que la sensibilité de détection minimale de la RT-qPCR pour le PoRV est de 6,0 × 10¹ copies/μL. Cependant, la détection par RT-qPCR repose sur l’établissement de courbes standard et de lignes de seuil Cq, ce qui peut entraîner des erreurs humaines. Compte tenu de la complexité et des volumes d’échantillons importants, la sensibilité de cette méthode est limitée par plusieurs facteurs de détection. Par conséquent, il est nécessaire d’établir une méthode plus précise pour la détection précoce des infections par le PoRV.
Avantages de la DDPCR
Les méthodes de détection traditionnelles rencontrent deux défis majeurs dans le diagnostic du PoRV. Premièrement, il existe souvent des inhibiteurs tels que les polysaccharides et l’hémoglobine dans les échantillons intestinaux de porc, ce qui peut facilement conduire à des résultats faussement négatifs. Deuxièmement, la charge virale est extrêmement faible au début de l’infection, et les méthodes conventionnelles sont difficiles à réaliser pour une détection précise avant l’apparition des symptômes. La réaction en chaîne par polymérase numérique en gouttelettes (DDPCR) disperse les échantillons en dizaines de milliers d’unités de réaction indépendantes grâce à la technologie de partitionnement en microgouttelettes, diluant efficacement les inhibiteurs dans les échantillons et améliorant considérablement la capacité anti-interférence. La DDPCR est une méthode de détection qui effectue une quantification absolue des gènes sans besoin de courbe standard. Pendant le processus de détection, un échantillon peut être divisé en jusqu’à 20 000 gouttelettes individuelles d’eau dans l’huile, et chaque échantillon subit des milliers d’amplifications PCR, avec le contenu viral dans chaque gouttelette évalué séparément. Par conséquent, l’impact des différences potentielles d’efficacité d’amplification et d’inhibition de l’amplification dans les échantillons sur les résultats de quantification virale est relativement faible. Le processus de distribution des échantillons concentre également efficacement le modèle dans les micro-réactions, améliorant la sensibilité de la détection des modèles de traces en réduisant la concurrence pour les réactifs d’amplification parmi les différentes cibles dans le mélange de réaction. L’algorithme de Poisson est utilisé pour calculer la concentration de gouttelettes positives dans l’échantillon et effectuer une quantification absolue, éliminant ainsi le besoin d’une courbe standard. Comparée à la RT-qPCR, la DDPCR offre des avantages tels que la quantification absolue, une moindre influence du système de détection et une haute sensibilité. La DDPCR a été largement appliquée dans de nombreux domaines tels que la certification alimentaire, l’identification des organismes génétiquement modifiés et les tests cliniques. Il est rapporté qu’actuellement en Chine, une méthode de détection DDPCR pour le PoRVA a été développée sur la base de la séquence conservée du gène VP6, et sa limite de détection minimale est de 3,97 copies/μL.
Conclusion
Dans cette étude, une DDPCR basée sur une sonde a été développée pour le gène Vp4 du PoRV afin de diagnostiquer l’infection par le PoRV. Cette méthode de détection, qui présente une haute sensibilité et spécificité, offre une approche efficace et une base scientifique pour le diagnostic différentiel précoce du PoRV dans l’industrie porcine.
🔗 **Fuente:** https://www.frontiersin.org/journals/veterinary-science/articles/10.3389/fvets.2026.1742171/full