La spectrophotométrie

Est une méthode scientifique utilisée pour mesurer la quantité de lumière absorbée par un produit chimique, en mesurant l’intensité de la lumière lorsqu’un faisceau lumineux traverse la solution échantillon, conformément à la loi de Beer-Lambert. Cette mesure peut également être utilisée pour mesurer la quantité d’un produit chimique connu dans une substance.La spectrophotométrie tire parti de l’absorption du rayonnement électromagnétique dans les domaines ultraviolet et visible du spectre.

L’échantillon absorbe une partie du rayonnement incident dans ce spectre et favorise la transition de l’analyte vers un état excité, transmettant un faisceau d’énergie radiante inférieure. Dans cette technique, la quantité de lumière absorbée est mesurée en fonction de la longueur d’onde utilisée. L’absorption des rayons ultraviolets, visibles et infrarouges dépend de la structure des molécules et est caractéristique de chaque substance chimique.

La spectrophotométrie visible dans l’ultraviolet utilise des faisceaux de rayonnement du spectre électromagnétique, dans la plage des UV allant de 180 à 380 nm et dans la plage de la lumière visible de 380 à 780 nm; il est donc très utile de caractériser les matériaux de la région. spectre ultraviolet et visible. On peut donc dire que la spectrophotométrie est la technique spectroscopique permettant d’évaluer la concentration ou la quantité de certaines espèces. Dans ces cas, l’instrument qui effectue de telles mesures est un spectrophotomètre, ces équipes ont fait leur apparition vers 1940, mais les premiers modèles ne pouvaient pas fonctionner dans l’ultraviolet, jusqu’à ce qu’Arnold O. Beckman en développe une version améliorée.

Qu’est-ce qu’un biophotomètre ?

Un biophotomètre est un micro-spectrophotomètre, ce qui en fait un instrument sophistiqué et approprié pour évaluer la qualité des échantillons d’acide nucléique (ADN, ARN) et des protéines. Indispensable dans les laboratoires de biologie moléculaire.

Quelle est l’importance de son utilisation ?

La purification de l’acide nucléique est l’une des applications les plus importantes dans les laboratoires moléculaires. La pureté et l’homogénéité de l’échantillon sont des considérations importantes pour les applications ultérieures. En pratique, les acides nucléiques sont purifiés à l’aide de kits disponibles dans le commerce, qui permettent la séparation de la plupart des composants cellulaires. Cependant, la présence de protéines ou d’autres composants organiques dans l’éluat peut ne pas être complètement éliminée.

Lors de la purification de l’acide nucléique sans kit, les produits chimiques utilisés dans le processus, tels que le phénol ou l’éthanol issu d’une extraction au phénol / chloroforme, posent des risques de contamination supplémentaires. Pour assurer une contamination minimale de l’échantillon, il est essentiel de vérifier sa pureté à l’aide de mesures photométriques. Les relations entre les valeurs d’absorbance aux longueurs d’onde de 230 nm, 260 nm et 280 nm (260 nm / 230 nm et 260 nm / 280 nm) fournissent une image claire de la pureté d’un échantillon d’acide nucléique. Les valeurs suivantes représentent un échantillon d’ADN pur: A260 / A230 ≥ 2,0 et A260 / A280 = 1,8 – 2,0

En général, la pureté d’une solution d’ADN peut être facilement définie par l’utilisation de ratios de pureté. Il est possible qu’une pureté réduite soit attribuée au fait que l’échantillon est solubilisé dans de l’eau plutôt que dans une solution tampon. Étant donné que l’eau et la solution tampon ont des propriétés différentes, cette disparité a une incidence sur l’absorbance de l’échantillon à mesurer.

Pour cette raison, certains biophotomètres sont capables d’enregistrer un «balayage de pureté» qui visualise graphiquement les propriétés d’absorbance d’un échantillon et permet donc un contrôle de qualité visuel rapide et simple. En outre, toutes les données brutes importantes appartenant à l’échantillon d’ADN sont affichées sous forme de tableau. Le tableau indique en option les rapports de pureté (A260 / A230 et A260 / A280), les valeurs d’absorbance (données brutes), ainsi que l’absorbance de fond, p. à 320 nm. Par conséquent, les deux formats de visualisation se complètent parfaitement pour permettre une évaluation de la qualité de l’échantillon d’ADN.

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