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Électrophorèse horizontale et verticale : Différences

L’électrophorèse sur gel est une technique de laboratoire utilisée en génétique pour séparer des mélanges contenant de l’ADN, de l’ARN et d’autres protéines en fonction de leur taille et de leur charge moléculaire respectives. L’ADN, l’ARN ou les protéines qui doivent être séparés dans cette méthode sont passés à travers un gel contenant de petits pores. Les molécules sont entraînées à travers le gel par un champ électrique.

Électrophorèse horizontale sur gel

L’électrophorèse horizontale sur gel utilise la théorie de base pour la séparation des molécules d’ADN, d’ARN ou de protéines en fonction de leur taille et de leur charge moléculaire respectives. Dans cette technique, le gel est présent dans une orientation horizontale et est immergé dans un tampon qui est continu. Le gel d’agarose est utilisé pour séparer la boîte de gel en deux compartiments. Une extrémité de la boîte de gel contient une anode, tandis que l’autre extrémité contient une cathode. Lorsqu’un courant est appliqué, le tampon utilisé dans cette technique permet la création d’un gradient de charge. Lorsque la charge est appliquée, le gel a tendance à chauffer.

Le tampon fonctionne également comme un liquide de refroidissement, maintenant la température à des niveaux optimaux. La recirculation du tampon courant empêche la formation d’un gradient de pH. Un système de tampon discontinu ne peut pas être utilisé dans l’électrophorèse sur gel horizontale car les deux compartiments du système de gel se connectent avec le tampon en cours d’exécution.

Dans l’électrophorèse horizontale sur gel, l’acrylamide ne peut pas être utilisé car la boîte de gel est exposée à l’oxygène. En raison de la présence d’oxygène, la polymérisation de l’acrylamide est inhibée, ce qui interfère avec la formation de gel. L’électrophorèse horizontale sur gel est une méthode sans effort utilisée dans la séparation de l’ADN et de l’ARN.

Électrophorèse verticale sur gel

La technique d’électrophorèse sur gel verticale fonctionne selon la théorie primaire de l’électrophorèse sur gel, mais est considérée comme plus complexe que la méthode d’électrophorèse sur gel horizontale. Cette technique utilise un tampon discontinu. Une cathode est située dans la chambre supérieure et l’anode est située dans la chambre inférieure. Les électrodes présentes dans chaque compartiment fournissent le champ électrique requis. Une fine couche de gel est versée entre les deux plaques de verre montées. Par conséquent, la partie supérieure du gel est immergée dans la chambre supérieure et la partie inférieure du gel est immergée dans la chambre inférieure. Une fois le courant appliqué, une petite partie du tampon se déplace vers la chambre inférieure de la chambre supérieure à travers le gel.

Dans l’électrophorèse verticale sur gel, le tampon ne traverse que le gel. Cela permet un contrôle précis du gradient de tension pendant l’étape de séparation. Le gel d’acrylamide peut être utilisé car les compartiments ne sont pas exposés à l’oxygène de l’air. En raison de la taille plus petite des pores du gel d’acrylamide, une séparation précise peut être obtenue avec une résolution plus élevée.

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Électrophorèse de l’hémoglobine et des hémoglobinopathies

Généralement, les syndromes cliniques résultant d’altérations de l’hémoglobine (Hb) sont connus sous le nom d’hémoglobinopathies et plusieurs tests de laboratoire sont interprétés comme tels, le plus pertinent étant l’électrophorèse d’Hb (EF).

La molécule Hb 1 humaine est formée de 2 paires de chaînes de globine et une molécule d’hème est attachée à chacune d’elles. Physiologiquement, 6 variantes sont formées: Trois variantes embryonnaires transitoires, appelées Hb Gower 1, Hb Gower 2 et Hb Portland, HbF, qui prédomine dans la vie foetale, HbA, qui constitue plus de 95% de l’Hb adulte et HbA2, présente également dans un pourcentage plus faible (1-3,5%) chez les enfants et les adultes.

Il existe de nombreuses variantes d’Hb génétiquement déterminées (héritées) et bien que la plupart soient inoffensives, d’autres provoquent des altérations cliniques remarquables.

Les hémoglobinopathies peuvent être regroupées en 3 catégories fondamentales, les plus pertinentes étant les 2 premières:

– Variants Les variantes structurelles de l’Hb, telles que l’HbS (drépanocytose ou drépanocytose).

– Échec dans la synthèse d’une quantité adéquate d’Hb (thalassémie) normale par défaut dans la production d’une ou plusieurs chaînes de la globine.

– Échec lors du saut normal chez le nouveau-né de produire de l’HbF en HbA (persistance héréditaire de l’Hb chez le fœtus).

L’investigation des patients présentant une suspicion d’hémoglobinopathie doit inclure les antécédents complets avec antécédents familiaux, examen physique et analyses de laboratoire. Ces tests avaient déjà été définis en 1975 par un groupe d’experts du Comité international de normalisation en hématologie: décompte des séries rouges avec indices; L’hémoglobine; hématocrite; frottis de sang périphérique; les réticulocytes; métabolisme du fer; test de solubilité; test de falciformation; quantification de HbA2 et HbF, et EF de Hb à pH alcalin. Si l’Hb détectée est instable ou a une affinité pour l’oxygène altéré, le test de stabilité thermique (par la chaleur) et chimique (isopropanol) doit être ajouté. De cette manière, un diagnostic fiable peut être établi dans la plupart des cas, bien qu’il soit parfois nécessaire de recourir à des techniques plus sophistiquées telles que EF à pH acide, l’étude des globines, la focalisation isoélectrique ou même l’analyse de l’ADN moléculaire.

Electrophorèse dans l’acétate de cellulose à pH alcalin

Ce type de EF est effectué en routine à un pH de 8,4 à 8,6 en utilisant une membrane d’acétate de cellulose comme substrat. Il s’agit d’une méthode simple, rapide et sensible. Détecte les variantes d’Hb les plus courantes et constitue traditionnellement la technique la plus utilisée pour l’évaluation initiale. Au pH alcalin, l’Hb est une protéine chargée négativement qui migre vers l’anode (+) dans un champ électrique. Les variants d’Hb avec des charges différentes à leur surface sont séparés de l’HbA et, par conséquent, tous les détectés sont différents. Hb peut être anormale sans modification de la charge et ne sera donc pas différenciée. Avec cette technique, on obtient une séparation de HbC, S, F, A et J. Lorsqu’une variante est détectée, il est utile de quantifier le pourcentage.

Quelles difficultés d’interprétation peuvent être présentées dans cette analyse?

– Il peut être difficile de détecter des bandes mineures telles que Hb Constant Spring, HbA2, Hb Bart et HbH.

– Chez le nouveau-né, qui contient de petites quantités d’HbA et d’énormes quantités d’HbF, il peut être difficile de détecter l’HbA. C’est pourquoi vous devez toujours recourir à EF dans de la gélose au citrate lorsque l’HbA n’est pas détectée, ou pour utiliser la focalisation isoélectrique.

– Il n’est pas possible de différencier HbS, D et G. Il n’est pas possible de différencier HbC, E et O. Par conséquent, tous les échantillons dans lesquels une seule bande est détectée en position HbS ou C doivent également être analysés. à la gélose au citrate ou à la focalisation isoélectrique pour exclure la présence d’hétérozygotes composés tels que HbSD, SG, CE ou CO.

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